“中山艦事件”發生之前，周恩來在黃埔軍校和國民革命軍第一軍的地位非同一般，由他執掌的政治部和教練部、教育部並稱為黃埔“三大支柱”，並擔任第一軍副黨代表兼政治部主任。
但是，周恩來視黨的利益高於一切，黨性、原則性非常之強，絕不輕易拿其做交易。東征期間，蔣介石曾專門詢問過中共在黃埔的情形，希望交出中共黨員名單。當時，蔣介石正處於上升發展趨勢，又是頂頭上司，但周恩來的態度仍然不卑不亢，絲毫沒有半點猶豫和迴旋：
“此事關係兩黨，須請示中央才能決定。”
碰了釘子的蔣介石一臉悻悻然，把此事狠狠地記在了心裏，同時也領教了共產黨人威武不能屈、富貴不能淫的高風亮節。“中山艦事件”發生後，蔣介石便趁機對周恩來採取了一連串的打擊行動和防範措施。
事件發生第二天，周恩來從包惠僧那裏得知了消息，當即趕到蔣介石的臨時指揮所——造幣廠去詢問詳情。到了那裏，作為一名高級軍官，他卻受到了極其粗暴的待遇，帶去的四個衛兵都被繳了械，他本人遭到軟禁。蔣介石信口雌黃，一口咬定中山艦事件乃是一起針對他個人的“陰謀”。在不明真相的情況下，周恩來保持了克制，但強烈要求蔣介石釋放所有被監禁的共產黨員。他十分堅定地保證，不管“中山艦事件”真相如何，但有一點可以肯定，那就是與中共無關。
形勢愈來愈複雜，蔣介石向中共提出了十分苛刻的要求，所有共產黨員要退出第一軍：不退出的要交出名單。
“蔣介石欺人太甚！”中共廣東區委負責人陳延年臉色十分嚴峻地說，他堅決主張對蔣介石展開有力反擊。
周恩來非常支援陳延年的建議，他認為要對蔣介石的反動行為保持高度警惕，不能掉以輕心，目前的情況是，國民革命軍六個軍中，只有第一軍是由蔣介石親自指揮的。而在第一軍的三個師中，有兩個師的黨代表是共產黨員，九個團的黨代表，中共佔了七位。另外，還有金佛莊、郭俊兩名共產黨員任團長職務，直接擁有軍隊指揮權；營以下各級軍官和部隊中的共產黨員也不少，且都是軍中骨幹力量。至於同情革命的左派勢力就更大了。更何況第一軍又是以黃埔教導團為基幹擴編而成的，只要態度堅決，反擊得當，是完全可以與蔣介石一較雌雄的。
然而，周恩來等人的正確建議，最終遭到了陳獨秀的否定。在當時右傾路線佔上風的中央領導班子的影響下，採取了妥協退讓的政策，失去了與蔣介石武裝抗衡的有利時機。就這樣，250余名公開暴露身份的共產黨員被迫退出第一軍和黃埔軍校，周恩來也被免去第一軍副黨代表和政治部主任的職務。陳延年因為這件事，氣得大罵他的父親陳獨秀是“老糊塗”。毛澤東則一針見血地指出，“重要之點不在此，在於蔣介石從此更加趾高氣揚，在於國民黨右派會加強活動，對我們挑釁。”而身處風口浪尖、矛盾旋渦中的周恩來，卻充分展示了他後來一貫的人格魅力，一方面忍辱負重，堅決執行中央決議，一方面力盡所能地將損失減少到最低限度。根據他的指示，第一軍中的共產黨員，凡身份未曾暴露者，仍然秘密留下來，以便日後形勢有所轉機，繼續發揮作用。
這一段時間，周恩來忍受著來自各方面的壓力和誤會。被迫撤離第一軍和黃埔軍校的二百多名中共黨員幹部以及政治工作人員，由國民黨軍事委員會政治訓練部在廣州大佛寺舉辦一個所謂高級政治訓練班。事實上，這些都是被蔣介石打入“另冊”、需要特別加以防範的“危險人物”，由周恩來擔任這個訓練班的主任。試想，由第一軍政治部主任下來擔任訓練班主任，其聲望、威信和影響自不必言，為非常人所能接受，蔣介石仍不甘心，還要肆意找茬折磨他，三番兩次去訓練班講話，信口雌黃，對中共及左派進行攻擊。身處逆境的周恩來並未因而沮喪，仍然一絲不茍地做好本職工作，這個訓練班被他辦得有聲有色，他先後向學員作了“反吳(佩孚)與反帝國主義”、“中國政治軍事的觀察”、“政治工作的設施及運用”等演講，在他樂觀向上的精神感召下，所有學員精神飽滿，思想活躍，情緒穩定。三個月學習期滿後，大多數人被分配到國民革命軍其他部隊工作，繼續發揮著重要作用。
在任訓練班主任期間，中共中央代表張國燾專程從上海趕到廣州，處理中山艦事件。在中共內部，張國燾以處事果斷、作風專橫著稱，大家也都對他寄予很大的希望，希望他能拿出一個合理有效的解決辦法。
令人失望的是，張國燾仍然死抱著右傾機會主義路線不放，下車伊始，便不分青紅皂白地將廣州的中共頭面人物挨個數落一番，指責廣東區委專支援蔣介石，視黃埔為軍事建設中心，忽略了各軍的平衡發展，尤其是在黃埔擔任重要職務的周恩來更是難辭其咎。這種不負責的批評完全缺少事實依據，在周恩來等一大批共產黨人的努力下，黃埔軍從無到有，從弱到強，成為當時最具朝氣、最具理想、戰鬥力最強的新型軍隊，這一事實，誰也無法抹殺。
到廣州的第二天，張國燾在周恩來的陪同下，去找蔣介石直接談判。重新踏上黃埔島，周恩來的情緒不免有些激動，如今，黃埔軍校往日那種火熱的、活潑向上的革命氣象已蕩然無存，代之以森嚴、冷肅，令人窒息。所以，周恩來的臉色十分沉峻。張國燾卻是一個勁地刻意討好蔣介石，他聲稱是代表中央專程來看望蔣介石的，他並承認黃埔同學中的中共黨員犯有錯誤，希望蔣介石大人大量，能原諒並教育他們，他們是一向愛戴和服從他的。
面對張國燾的軟弱和阿諛，蔣介石更是盛氣淩人，對張國燾愛理不理。坐在一邊的周恩來卻是冷眼旁觀，不卑不亢。鋻於中共中央對此事已定下基調，周恩來儘管有所不滿，但只能三緘其口，張國燾甚至諷刺他為“噤若寒蟬”。然而，正是在這種默默忍受中，鍛鍊了他的非凡毅力、涵養、韌勁和靈活的工作作風，頗有眼力的蔣介石從來沒有輕視過周恩來的能力和分量。
退出第一軍後，周恩來開始主持中共廣東區委軍委工作，為北伐戰爭做前期準備，儘管幹部力量不足，只有聶榮臻和黃錦輝二人，但各項工作仍然有條不紊地進行著。
隨著北伐計劃進入實施階段，蔣介石成立了北伐軍總司令部，張治中特別向蔣鄭重推薦周恩來擔任總司令部政治部主任一職，但蔣介石一口回絕，稱心中已有合適人選，擬請鄧演達出任。其實，蔣介石心裏的算盤是不讓周鄧各展其長，鄧演達在黃埔軍人中的威信，幾欲直逼他蔣介石本人，又是著名左派，千萬不能讓他親自帶兵，與軍隊的聯繫過於緊密；而周恩來經過中山艦事件的洗禮後，變得更加成熟、沉穩，如讓他做政治部主任，幾年之後，士兵的頭腦大概都要被共產黨清洗一遍了。因此，他的態度很堅決，周恩來進總司令部可以，但只能擔任經濟部主任這樣的事務性的角色，張治中只得怏怏而去。
對於這一安排，周恩來認為蔣介石太虛偽，也太小心眼了，置北伐大業于不顧，處處為一己私利打算，所以他斷然拒絕。
周恩來的憤怒如同夏天的暴雨，倏然而來，倏然而去。很快，他就重新調整了情緒，表現出一派大將風度，邀請張治中出席宴會。根據黨的指示，他和包惠僧假廣州永漢北路財政廳屬“太平餐館”宴請第一軍出征將士，以表中共方面對北伐的支援和誠意。
參加宴會的都是周恩來在黃埔的同事，有第一軍副軍長兼第1師師長王柏齡、第2師師長劉峙、第20師師長兼廣州警備司令錢大鈞，還有總司令部軍需處長渝飛鵬等20余人。從這份名單上就可以看出共產黨人的心胸，像王柏齡、劉峙之流都是鐵桿右派分子，也是中山艦事件中蔣介石的打手，但共產黨人不咎以往，一切從北伐大局出發，以北伐大計為重。
周恩來滿面春風，高擎酒杯，用他特有的鄉音，朗朗祝道：“諸位將領出征在即，無以為敬，特備薄酒，為各位餞行，以壯行色。”坐在周恩來對面的張治中對周恩來的敬佩不由地更加深了一層，剛才與他分手時，還見他怒髮沖冠，而轉眼一瞬之間，卻見他嘴角含春，笑意暖人，只有共產黨人才有此胸襟，有此度量，不能不讓人平添幾分好感，幾分同情。
這一次的宴會雖然形式上是為北伐軍上前線作戰的將領餞行，不過是私人的應酬而已。實質上是共產黨為了鞏固國共兩黨的聯合戰線的一個政治任務。在喝酒與吃茶的當中，周恩來很勇敢地打了兩次通關，輸了拳就很痛快地乾杯，贏了拳就很嚴肅地舉起酒杯等待對方喝酒，他那簡潔明瞭的語調、閃爍動人的目光，執行酒令時大公無私的態度，全場都為之喝彩，就是王柏齡那樣姦狡巨猾的人物，輸了拳也不敢抵賴，俯首貼耳地喝酒。
1926年7月，北伐戰爭終於全面發動，隨著革命中心由南向北的轉移，度過中山艦事件風波的周恩來也奉命調中共中央工作，投入到另一個全新的戰場。
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